產(chǎn)品描述
　　Quick Cell PCR法支原體檢測(cè)試劑盒，本試劑盒采用一對(duì)支原體特異性引物，用于對(duì)樣品的支原體基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后通過瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。試劑盒內(nèi)同時(shí)含有內(nèi)參對(duì)照，用于監(jiān)控PCR是否正常擴(kuò)增。

　　本試劑盒與MB Zell Shield 13-0050等產(chǎn)品相比更具優(yōu)勢(shì)，替代性強(qiáng)，具體情況可詳見下文或咨詢銷售人員。
　　本試劑盒是一種廣譜的支原體檢測(cè)試劑盒，可以識(shí)別所有100多種至今已發(fā)現(xiàn)的支原體；能用于檢測(cè)一切可能含支原體的樣品，比如：體外細(xì)胞培養(yǎng)的上清；血清；各種體液，如唾液、尿液、鼻腔分泌物等；其他液體樣品等。具有100%支原體識(shí)別率、靈敏度*、含內(nèi)參條帶從而可以區(qū)分真陰性樣品和假陰性樣品、無需配套相對(duì)昂貴的熒光定量PCR儀等優(yōu)點(diǎn)。
　　經(jīng)多次測(cè)試，本試劑盒有記錄可以識(shí)別在體外細(xì)胞培養(yǎng)中曾經(jīng)報(bào)道出現(xiàn)的20種支原體，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，這些支原體基本能占污染細(xì)胞的支原體種類的100%。具體如下：（1）M. hyorhinis、（2）M. fermentans、（3）M. arginini、（4）M. hominis、（5）M. orale、（6）M. salivarium、（7）M.pirum、（8）A. laidlawii、（9）M. agalactiae、（10）M. bovis、（11）M. bovoculi、（12）A. axanthum、（13）M. buccale、（14）M. pneumoniae、（15）M. arthritidis、（16）M. pulmonis、（17）M. gallisepticum、（18）M. gallinarum、（19）M. canis、（20）Ureaplasma urealyticum（注：M.為Mycoplasma的縮寫; A.為Acholeplasma的縮寫）。

訂購(gòu)信息

【注】：
以下試劑需要自行準(zhǔn)備：①普通的Taq DNA 聚合酶（推薦使用 Takara 品牌的Ex Taq Hot Start version，貨號(hào)：RR006A，已包含2.5 mM 的 dNTP）和相應(yīng)的緩沖液；② 2.5 mM的dNTP；③DNA上樣緩沖液（推薦使用李記生物的GelRed預(yù)染DNA上樣緩沖液(5X)，貨號(hào)：AN34L047，該緩沖液已含無毒核酸染料，不需要接觸 EB 等致癌物質(zhì)）。
運(yùn)輸與保存條件
　　冰袋運(yùn)輸，-20℃保存，可以保存五年。
使用方法
1.待測(cè)樣品的準(zhǔn)備
取換液后培養(yǎng)2-3 d且匯合度在90%左右的細(xì)胞培養(yǎng)液上清（貼壁細(xì)胞）。懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞在換液傳代后，生長(zhǎng)2-3 d再取培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)?？梢园凑找韵聝煞N方法之一進(jìn)行樣品的前處理：
方法一
（1）取 150μL上述待測(cè)樣品到1.5 mL離心管內(nèi)，在普通臺(tái)式離心機(jī)上1000 rpm 低速離心5 min；
（2）上述離心上清液，95 ℃加熱處理5 min（可以轉(zhuǎn)移到 PCR 管內(nèi)，在 PCR 儀上進(jìn)行加熱處理），簡(jiǎn)單離心（1000g，5 s）后，取上清進(jìn)行檢測(cè)。
方法二（推薦本方法，有高速離心機(jī)的的可選用本方法，可以去PCR抑制物，準(zhǔn)確性更高。）
（1）根據(jù)濃縮倍數(shù)，可以取100 - 1500μL上述待測(cè)樣品到1.5 mL離心管內(nèi)，普通臺(tái)式離心機(jī)1000 rpm 離心5 min，將離心后的上清轉(zhuǎn)移到另一個(gè)離心管內(nèi)，丟棄細(xì)胞沉淀。
（2）將上清繼續(xù)13000 rpm（約16000 g）高速離心5 min，小心吸走全部上清，用50μL 5 mM Tris-HCl,pH 8.5（推薦使用，樣品可以長(zhǎng)期保存）或者去離子水（樣品比較不穩(wěn)定，只適合當(dāng)天或短期內(nèi)檢測(cè)使用）重懸、沉淀（沉淀中含有支原體），吹吸均勻。
（3）該重懸后的樣品可以直接檢測(cè)，也可以進(jìn)行熱處理后再檢測(cè)（熱處理后，樣品保存更穩(wěn)定）。熱處理具體如下：95 ℃加熱處理 5 min（可以轉(zhuǎn)移到PCR管內(nèi)，在PCR儀上進(jìn)行加熱處理），簡(jiǎn)單離心（1000g，5 s）后，取上清進(jìn)行檢測(cè)。
【注】：
① 這里的細(xì)胞培養(yǎng)上清不是指細(xì)胞經(jīng)*酶消化后的離心上清，而是指至少培養(yǎng) 2 d后的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)液上清或懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液；
② 本步驟的低速離心是為了去除哺乳動(dòng)物細(xì)胞，以排除其不必要的干擾。所以離心力要嚴(yán)格控制在150-200 g，該離心力下，哺乳動(dòng)物細(xì)胞將被沉淀下來而支原體不會(huì)；
③ 收集的待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液樣品如果不立即檢測(cè)，請(qǐng)放于-20℃或-80℃冰箱保存；
④ 如果預(yù)期待測(cè)樣品支原體含量較少（比如低溫保存的血清、臍帶血、*mei、抗生素、未使用的培養(yǎng)液、生物制品、極個(gè)別細(xì)胞培養(yǎng)上清等），可以采取措施以提高檢測(cè)的靈敏度，具體方法請(qǐng)看后文注意事項(xiàng)部分：如何提高本試劑盒檢測(cè)靈敏度。
2.PCR 體系的配制  
（1）按照25μL體系配制比例如下。如果是多樣品檢測(cè)，加兩個(gè)對(duì)照樣品后各組分總體積如下表。配制好的混合液，按每管23μL分裝到0.2 mL的PCR管中。

【注】：
① 總體積中多配制 6% 是為了防止移液導(dǎo)致誤差，以保證每個(gè)反應(yīng)管中的反應(yīng)液足量；
② 如果有條件，PCR 體系的配制建議在冰上進(jìn)行操作；
③ 本試劑盒不推薦使用 2× 的 PCR mixture（內(nèi)含 Taq 酶、緩沖液和 dNTP），建議使用Taq酶、10×Taq 緩沖液和 dNTP 等試劑配制PCR體系；
④ 為了避免可能的污染，收到的支原體引物和內(nèi)參，可以適當(dāng)分裝（比如：每支 40μL）后冷凍保存；
⑤ 如果使用的是其他 Taq 酶（前提是：陰性對(duì)照的 586 bp 內(nèi)參條帶必須有一定亮度，且穩(wěn)定性良好，否則不能使用），酶、去離子水的加入量需要根據(jù)其說明書進(jìn)行調(diào)整。
（2）加入待測(cè)樣品、陰性和陽(yáng)性對(duì)照樣品。樣品檢測(cè)管中加入2μL待測(cè)樣品，陰性對(duì)照管加入2μL去離子水，陽(yáng)性對(duì)照管加入2μL陽(yáng)性支原體 DNA。
【注】：
① 裝有陽(yáng)性支原體 DNA 的螺口管開蓋之前，低速離心或用手指捏住，用力甩一下即可；
② 進(jìn)行反應(yīng)體系配制的房間，與樣品前處理、加陽(yáng)性對(duì)照DNA、樣品DNA的房間建議分開。
3.PCR 參數(shù)設(shè)置

4.PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳
　　配制含溴化乙錠（EB）的濃度為 1.5%的 DNA 瓊脂糖凝膠（推薦使用李記生物的GelRed預(yù)染DNA上樣緩沖液(5X)，貨號(hào)：AN34L047，該產(chǎn)品預(yù)添加了無毒安全染料）；當(dāng)溴酚藍(lán)染料跑出上樣孔 3-4 cm時(shí)，停止電泳，拍照。
5.結(jié)果判斷  
PCR 擴(kuò)增的結(jié)果有可能出現(xiàn)以下幾種情況：

　　支原體 PCR 擴(kuò)增結(jié)果：586 bp 條帶為內(nèi)參條帶，270 bp 左右的條帶為支原體特異條帶（各支原體的條帶大小會(huì)略有不同，總體在 266-280 bp 之間。注意：支原體特異條帶的大小不會(huì)超過該范圍。超過該范圍的，就是雜帶?。?。隨著支原體 DNA 模板的增加，270 bp 左右的條帶會(huì)逐漸增強(qiáng)而 586 bp 的內(nèi)參條帶會(huì)逐漸減弱，甚至消失。
　　泳道1：陰性對(duì)照或者沒有支原體污染的樣品；
　　泳道2：極重度支原體污染樣品；
　　泳道3：重度污染樣品；
　　泳道4：中度污染樣品；
　　泳道5：輕度污染樣品；
　　泳道6：PCR 的擴(kuò)增被細(xì)胞的代謝產(chǎn)物抑制，導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。
　　M：DNA marker.
注意事項(xiàng)
1.設(shè)有陰性對(duì)照，保證本試劑盒含有的支原體引物和內(nèi)參以及整個(gè)反應(yīng)體系正常。
2.只有當(dāng)陰性對(duì)照的結(jié)果沒有出現(xiàn) 270 bp 左右的支原體特異條帶時(shí)，其他樣品的檢測(cè)結(jié)果才是可信的。
3.每次試驗(yàn)陰性對(duì)照中 586 bp 的內(nèi)參條帶都必須出現(xiàn)而且要有一定的亮度，才說明試驗(yàn)成功。如果陰性對(duì)照的內(nèi)參條帶經(jīng)常沒有出現(xiàn)或者非常弱，說明試驗(yàn)不成功，這時(shí)可以采取以下幾個(gè)措施： a.請(qǐng)使用普通蒸餾水或去離子水。不能使用去內(nèi)毒素的水、DEPC 處理的水或者商品化的 DNase/RNase-free的水，這幾種水都可能會(huì)抑制 PCR 擴(kuò)增的效率。 b.請(qǐng)使用 Takara 公司的 Ex Taq Hot Start version（推薦。貨號(hào)： RR006A，可用 400 次）。 c.可以嘗試增加 PCR 的循環(huán)數(shù)，比如：由原來的 40 個(gè)循環(huán)，增加到 45 個(gè)循環(huán)。如果采取以上幾個(gè)措施后，陰性對(duì)照的內(nèi)參條帶仍然經(jīng)常沒有出現(xiàn)或者非常弱，請(qǐng)聯(lián)系廠家解決。
4.如果直接使用細(xì)胞培養(yǎng)液上清進(jìn)行檢測(cè)，而檢測(cè)結(jié)果顯示該樣品 586 bp 條帶和 270 bp 左右的條帶都沒有出現(xiàn)（如圖 1，泳道 6）或者內(nèi)參條帶非常微弱，在排除 PCR試劑的問題后,說明該樣品含有抑制 PCR 擴(kuò)增的代謝產(chǎn)物。
5.防 DNA 污染注意事項(xiàng)： a.強(qiáng)烈建議所有操作全部使用進(jìn)口濾芯吸頭（比如：Axygen 濾芯吸頭）進(jìn)行操作，以免試劑被污染。 b.“PCR 體系配制的房間、移液槍"（不要使用細(xì)胞培養(yǎng)室的移液槍?。┖汀癙CR 產(chǎn)物的電泳房間、移液槍"一定要分開，不能在同一個(gè)房間進(jìn)行，也不能使用相同的移液槍進(jìn)行操作。 c.PCR 產(chǎn)物是導(dǎo)致假陽(yáng)性的主要原因，PCR 產(chǎn)物不要在 PCR 體系配制的房間中打開。 d.樣品處理的房間和移液槍，如有條件，建議也分開。 e.收到的支原體引物和內(nèi)參，可以分裝（比如 40 μL一支）后保存。
6.如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞被支原體污染，推薦使用李記生物的Quick Cell支原體祛除預(yù)防試劑盒，貨號(hào)：AC16L066；以及EZ 水浴鍋抑菌劑，貨號(hào)：AC16L162 和 EZ 細(xì)胞房除菌劑，貨號(hào)：AC16L143。產(chǎn)品詳情可咨詢銷售人員或見李記生物網(wǎng)站。
7.支原體檢測(cè)樣品可以分成兩類：①用含血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞上清液，由于該條件非常適合支原體生長(zhǎng)，培養(yǎng)數(shù)天后，支原體密度一般較高，可達(dá) 10^7-9/mL，可以直接檢測(cè)。②低溫保存的血漿、血清、臍帶血、*酶、抗生素、未使用的培養(yǎng)液等樣品，由于這些樣品即使有支原體污染，支原體含量一般很少，直接使用快速支原體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，往往檢測(cè)不出來。這些樣品建議：（1）對(duì)樣品的支原體進(jìn)行離心濃縮處理；（2）使用支原體液體培養(yǎng)基（必須同時(shí)接種不含jing氨酸和含jing氨酸的兩種支原體液體培養(yǎng)基）培養(yǎng) 3-7 d后，再進(jìn)行檢測(cè)。具體方法請(qǐng)參考李記生物 Quick Cell 發(fā)光法支原體檢測(cè)試劑盒，貨號(hào)：AC16L062 說明書中后的注意事項(xiàng)部分。該方法速度較慢，需要 3-7 d，但是可靠性高。
8.該產(chǎn)品主要用于細(xì)胞上清支原體污染檢測(cè)，僅限于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。
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